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      怎樣制備高質量的抗體—動物免疫有妙招

      2022-06-20
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      傳統的抗體制備都是從抗原刺激免疫動物產生強烈免疫應答開始,其中單克隆抗體是從免疫動物脾臟取B細胞與無限增殖的瘤細胞體外融合,對融合成功的雜交瘤細胞進行亞克隆,從而根據應用目的篩選對應的細胞株,然后通過細胞培養或收集腹水進一步純化得到抗體;而多克隆抗體是采集動物抗血清,直接親和純化得到抗體。不管是哪種抗體的制備,都離不開高效的動物免疫。

      單克隆抗體的制備流程示意圖多克隆抗體的制備流程示意圖

          動物免疫利用的是生物體自身的體液免疫應答機制,通過抗原的持續刺激先后啟動初級免疫反應和次級免疫反應,實際操作中以血清中抗體效價來衡量實際免疫效果??乖碳C體后啟動初級反應一般會有一個滯后期,此時幼B細胞經過克隆篩選、增殖,然后分化成記憶細胞或漿細胞。經過滯后期,血清效價呈指數增長達到一個峰值然后下降。初級免疫反應中,會首先分泌IgM,然后經過抗體亞型轉換,IgG比例會升高。

      次級免疫反應的啟動依賴于記憶B細胞和記憶T細胞的數目,記憶細胞再次遇到相同抗原就能被激活,從而導致次級免疫反應的發生。當記憶細胞數目遠大于幼B細胞時,次級反應啟動更快、強度更大。次級反應相比初級反應滯后期更短,漿細胞和血清效價的峰值更高,持續時間更長。同時,此時分泌的抗體經過親和力成熟和亞型轉換,質量更高。

      一般免疫進程中血清效價變化曲線示意圖

      動物免疫一般選擇健康的年青成年雄性動物,免疫系統發育成熟且不受性周期的影響而發生波動。為確保動物在整個免疫進程中的健康無疫病狀態,除了對動物來源有要求外,飼養環境也需進行控制。嚴格來說,動物需飼養于SPF級屏障系統內,實施嚴格的微生物和寄生蟲控制。

      菲恩生物免疫基地小鼠飼養SPF級車間和兔飼養潔凈區

          通??乖枰扔米魟┤榛笤傩凶⑸?,抗體制備中最常用的弗氏佐劑主要成分為礦物油和羊毛脂,其中首次免疫需使用添加卡介苗或滅活的結核分枝桿菌的弗氏完全佐劑。佐劑的作用主要是延緩抗原的釋放,增強吞噬細胞的吞噬和對抗原的呈遞??乖瓨O為寶貴時可采用淋巴結內微量注射,此時可不使用佐劑,抗原只需10~100μg。

      開始一項免疫,除了上面提到的通用性原則,還需要考慮動物種屬的選擇、免疫劑量的使用、注射方式以及間隔時間的控制。

      01、抗原與免疫動物的種屬差異越遠越好;親緣關系太近,意味著抗原同源性高不被免疫系統識別;另外,要注意有些抗原在免疫某些種類動物時免疫原性極差,如胰島素對家兔、多種酶類(如胃蛋白酶原等)對山羊等,免疫時皆不易出現抗體。

      02、免疫劑量應根據抗原性強弱、分子量大小和免疫時間做相應調整??乖慷?,時間間隔長,劑量可適當加大。大動物抗原劑量(以蛋白抗原為準)約0.5~1mg/只,小動物約0.1~0.6mg/只。有時主觀希望加強免疫效果而不適當地加大劑量,往往會弄巧成拙。

      03、 免疫注射的途徑有多種,包括足掌、肘窩、頸背部等淋巴結密集區皮下和皮內注射,另外還有肌肉注射和靜脈注射。最廣泛使用的是皮下注射方式,某些情形下皮內注射有優勢。

      常見的免疫注射途徑

      04、免疫間隔時間也是重要因素,特別是首次與第二次之間更應注意。第一次免疫后,一般以間隔10~20天為好。二次以后每次的間隔一般為7~10天,不能太長,以防刺激變弱,抗體效價不高。免疫的總次數多為5~8次,半抗原需經長時間的免疫才能產生高效價抗體,有時總時間為一年以上。

      建議:實際操作中,免疫劑量、免疫部位以及間隔時間的組合都會對免疫結果產生較大影響,需對抗血清效價進行監控,根據實際的免疫效果調整,不可生搬硬套。


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